類器官——從 2D 到 3D 的進階

 

近年來，“類器官”（Organoids） 突然闖入我們的視野，2017 年，類器官被《自然方法》(Nature Methods) 評為生命科學領域年度技術，最近，類器官也被列入“十四五”國家重點研發專項，可謂潛力無限。

 

類器官技術“爆紅”的背后，是“趕時髦”科研還是有“真材實料”呢？

 

類器官不是器官

一直以來，“類器官”一詞被寬泛地用于所有來源于原代組織 (組織亞基或單細胞)、胚胎干細胞 (ESCs) 和誘導多能干細胞 (iPSCs)、已建立的細胞系以及完整或分段器官 (如由多種組織類型組成的器官外植體) 的三維 (3D) 器官型培養。

我們可以這樣理解類器官是完全由原代組織、ESCs 或 iPSCs 衍生而來的體外 3D 細胞簇，它們具有自我更新和自組織能力，并表現出與起源組織相似的器官功能。

 

“爆紅”絕非偶然

其實，3D 類器官培養是在上個世紀建立和發展起來的。早在 1907 年，Wilson 等人首次表明，分離的海綿細胞能夠自組織再生成整個生物體。2009 年，Hans Clevers 和同事在腸道類器官培養系統中取得突破性進展，開啟了類器官技術的發展“新紀元”。

目前，已有方法可以構建肝臟、結腸、腸道、腎臟、肺、前列腺、胰腺、胃、大腦皮層和視網膜等多種組織的類器官。體外類器官模型是一項重大的技術突破，它為研究組織發育、疾病建模、藥物篩選、個性化醫學和細胞治療提供了一個強大的工具 。

 

圖 1. 類器官技術的多樣化應用^[2]

 

■ 與傳統細胞培養及動物模型對比，其秀在何處？ 

1) 與傳統的體外培養不同，類器官在組成和結構上與原代組織 (Primary tissue) 相似：包含了少量基因組穩定、自我更新的干細胞，這些子代的細胞譜系與活組織的主要細胞譜系相似；

2) 類器官可以快速擴增、冷凍保存，且能應用于高通量分析；

3) 原發組織來源的類器官缺乏間充質/間質，為研究感興趣的組織類型提供了一種簡化的途徑，而不受局部微環境的干擾；

4) 類器官是傳統 2D 培養和體內小鼠模型之間的重要橋梁，因為它們比單層培養模型更具有生理相關性，而且比體內模型更易于操縱生態位成分、信號通路和基因組編輯。

 

圖 2. 建立小鼠可再生的腎類器官應用于腎毒性劑量定量篩選^[12]

文中所用 Noggin, R-spondin 1, SB431542, CHIR99021, FGF-4, FGF-basic 源自 MCE。

 

在藥物篩選 (Drug screening) 中，2D 培養缺乏組織結構和復雜性，這可能是藥物篩選結果多次不能重現體內環境的原因，而患者來源的類器官 (PDO) 高度概括了腫瘤來源的特征，具有更高的敏感性、異質性和穩定性，與傳統的患者來源的癌細胞系 (PDC) 模型和人源腫瘤異種移植 (PDX) 模型相比，具有無可比擬的優勢 (如圖 3)。

圖 3. 建立大腸癌患者源性類器官體外腫瘤模型^[13]

文中所用 Noggin, R-spondin 1, FGF-basic 源自 MCE。

 

此外，癌癥類器官還可以在芯片上進行保存、復蘇、無限傳遞和機械培養，用于藥物篩選。許多影響人類的致病病毒表現出物種特異性，對新型病毒生物學的理解很大程度上依賴于允許病毒復制的體外模型，近期，類器官被用于 COVID-19 的研究，彌合了細胞系和體內動物模型之間的差距。

 

這么多優點，應用這么廣泛，類器官技術這把火恐怕還不夠旺?！

 

圖 4. 類器官培養與 2D 細胞培養及動物實驗研究的比較^[5]

 

培養基中的“魔法”

類器官可以由兩種類型的細胞生成：1) 多能干細胞 (PSC)，例如胚胎干細胞 (ESC) 和誘導多能干細胞 (iPSC)；2) 器官限制性成體干細胞 (ASC)。在適當的條件下，用細胞外基質培養，如 Matrigel，輔以各種生長因子，促進干細胞增殖與分化，并自組織成功能性 3D 結構。

 

各種組織的類器官的培養方法是類似的，可以簡單得概括為：

1) 類器官可以從原代組織中產生，把原生組織被分解成含有干細胞的功能性亞組織單元，再進一步消化成單個細胞并進行流式細胞分選以富集干細胞。源自 ESC 和 iPSC 的類器官向所需的胚系進行定向分化，最終聚集產生浮動的球狀體，隨后被嵌入細胞外基質開始類器官培養（如圖 5）。 

圖 5. 從 ASCs 生成類器官的方法示意圖^[14]

將小腸組織切成幾塊(隱窩分離出來可做備選)。將小塊組織與諸如膠原酶等在37℃下孵育，形成細胞懸浮液。將單細胞接種在 Matrigel 中，并在含有特定組織生長因子的培養基中生長。

2) 可操縱的培養系統實現定向分化：類器官通常在細胞外基質 (ECM) 中進行培養，ECM 周圍是補充了類器官類型特定的生態位 (Niche) 因子的培養基。常見的 Niche 和 ECM 因子包括了 R-spondin、EGF、Noggin、Activin A、Collagen 等。

3) 干細胞在類器官中保持并長存，即保持“干性”，并且不斷產生分化的多種細胞類型子代，這些細胞類型自組織成功能性 3D 結構。另外，3D 類器官可以解離，并鍍到涂有基底膜基質 (MG) 或膠原蛋白 (collagen) 的膜支持物上，形成 2D 單層類器官模型。

 

圖 6. 原代組織和 ESCs/iPSCs 產生和培養類器官^[6]

類器官可自發地分化，或通過添加適當的分化因子和/或撤除促進干細胞特性的因子，以誘導分化得到所需的譜系或細胞類型。

 

類器官的培養離不開誘導細胞分化的細胞因子，MCE 提供各種類器官培養用細胞因子，高活性、高純度、低內毒素！此外，類器官培養所需小分子小 M 也一并貼心奉上~~向培養基中加入神奇“魔法”，收獲強大的研究工具！

細胞因子

Human EGF 上皮組織生長因子；EGF 與 EGF 受體結合，誘導增生性變化。 胃腸道、肝臟、甲狀腺、腦等類器官培養所需因子。

Human FGF-2/4/9/10 FGFs 在早期發育中對中胚層誘導、肢體發育、神經誘導和神經發育有重要作用。在成熟組織中，FGFs 對血管生成、角質形成細胞組織和傷口愈合過程至關重要。 例如 FGF-basic (FGF-2)、FGF-10 是常見的類器官培養 Niche 因子，如肝臟類器官、前列腺類器官。

Human HGF HGF/Met 信號通路促進腫瘤的生長、侵襲和遷移。 HGF 可充當肝細胞的有絲分裂原，用于肝類器官培養。

Human Wnt3a Wnt 參與調節細胞發育、增殖、分化、粘附、極性、細胞-細胞通信、生存和自我更新功能。 Wnt3a 在類器官的擴展能力中起著重要的作用，是最常用培養因子之一。

Human BMP-4 BMP 在胚胎發生、發育和維持組織穩態中起著至關重要的作用。  體外實驗中，BMP-2 和 BMP-4 被廣泛應用于誘導多能干細胞 (iPSC) 和胚胎干細胞 (ESC) 產生肝細胞。

Human Noggin 骨形態發生蛋白的內源性抑制劑，調節細胞分化、增殖和凋亡。 Noggin 是最基礎的類器官培養因子之一。

Human DKK-1 DKK-1 是典型的 Wnt 抑制劑，可誘導視網膜前體自組織。

小分子抑制劑

Y-27632 dihydrochloride  Rho 激酶抑制劑；常用于類器官構建。

A 83-01 ALK4/5/7 抑制劑；抑制類器官的增殖。

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參考文獻

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1. Madeline A Lancaster, Juergen A. Knoblich. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.

2. Claudia Corrò, Vivian S.W. Li, et al. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.

3. Marina Simian, Mina J Bissell. Organoids: A historical perspective of thinking in three