【干貨】WB, IHC實驗問題總結與處理方案（文末有彩蛋）
1、western blot 的優點
答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。
2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？
答：原因有很多：
a) 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；
b) 你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質分子量很?。?0KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。
7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；
d) 二抗失活。
9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。
10、DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。
11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？
答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。
12、蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉上去了，為什么？
答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉移時間不夠。
13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。
② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：
1，樣品不能反復凍融；
2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了。
17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，加20％甲醇。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
答：200kd的蛋白不好做， 分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？
答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。
27、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上樣量？
答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b)用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性
30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？
答：上樣量要根據實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關系， 盡量多上就行了， 但是不要超載。
31、一抗，二抗的比例是否重要？
答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。
32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。
33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。
34、Western Blot 中抗體的可以重復應用嗎？
答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。
35、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？
答：可以。
37、轉膜后經麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉膜好象不是很好，為什么？
答：這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢， 你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。
38、做Western Blot時，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？
答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和免疫組化。
39、如果是6×8轉印膜，要加多少一抗？
答：一抗的稀釋度是有說明的，根據你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－5ml。
40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。
答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。
41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？
答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。
42、蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE， 濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
43、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？
答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）。
44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。
45、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？
答：對于發表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。
46、核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？
答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參。
47、做半定量Western Blot，內參β-actin，GAPDH哪個好？
答：選用beta-actin就可以。
48、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區別。
49、轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？
答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調節pH 至 7.4, 加水定容至 1L。
50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?
答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。
51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。
52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？
答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：
（1）電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55v，分離膠75v就能跑得很好。
（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.
53、為什么提高大分子量蛋白的轉移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?
答：小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。
1．電泳中常出現的一些現象：
●︶ 條帶呈笑臉狀
原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統溫度偏高。
●︵ 條帶呈皺眉狀
原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。
●拖尾
原因：樣品溶解不好。
●紋理（縱向條紋）
原因：樣品中含有不溶性顆粒。
●條帶偏斜
原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。
●條帶兩邊擴散
原因：加樣量過多。
2．Western blot結果中背景較高
可能的原因及建議：
●膜封閉不夠
延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。
●一抗稀釋度不適宜
對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
●一抗孵育的溫度偏高
建議4℃結合過夜。
●選擇的膜容易產生高背景
一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低。
●膜在實驗過程中干過
實驗過程中要注意保持膜的濕潤。
●檢測時曝光時間過長
減少曝光時間。
3．Western blot結果中雜帶較多
可能的原因及建議：
●目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙?；稽c等），本身可以呈現多條帶。
查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。
●目的蛋白有其它剪切本
查閱文獻或生物信息學分析可能性。
●樣本處理過程中目的蛋白發生降解
加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。
●上樣量過高，太敏感
適當減少上樣量。
●一抗特異性不高
重新選擇或制備高特異性的抗體。
●一抗不純
純化抗體
●一抗或者二抗濃度偏高
降低抗體濃度。
4 . Western blot結果中無信號或顯示信號弱
可能的原因及建議：
●檢測樣本不表達目的蛋白
選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。
●檢測樣本低表達目的蛋白
提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
●轉移不完全或過轉移
可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流。
●抗體不能識別測試種屬的相關蛋白
購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。
●一抗孵育時間不足
建議4℃結合過夜。
●二抗與一抗不匹配
選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
●洗膜過度
洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。
5. 其它現象：
●膜上多處出現黑點或黑斑
原因：抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。
●反白（條帶顯白色）
原因：目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。
●蛋白分子量偏低或偏高
原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。
6．安全問題：
操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發性試劑應在通風櫥中進行。
Q1：邊緣效應?
1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織。
2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。
Q2：產生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？
1） 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。
2） 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
3） 內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；
4） 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；
5） DAB孵育時間過長或濃度過高；
6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；
7） 標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。
Q3：免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些？
1）抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。
2）抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合;建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復。
3）組織切片本身這種抗原含量低；
4）血清封閉時間過長。
5）DAB孵育時間過短。
6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。
7）開始做免疫組化，一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。
Q4：背景強的原因?
1）考慮一抗濃度高；
2）然后調整DAB孵育時間；
3）也要考慮血清封閉時間是否過短
4）適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長浸洗時間等。
Q5：石蠟切片在染色過程中出現脫片現象？
1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度
2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做
3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織，
4）用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。
Q6：一抗從4度拿出后，為什么要進行37度復溫？
1） 一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
2） 另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
Q7：切片染色后背景太深，如何區分特異性與非特異性著色？
全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：
1）抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。
2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。
3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。
4）組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
5）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4ºC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。
6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
Q8：脫片產生的原因有哪些？
1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。
2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
3）沒烤好，時間短，溫度不夠之類。
4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。
5）修復的問題：抗原修復的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。
6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
7）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。
Q9：DAB顯色后發現切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？
1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。
2）有可能是你 顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區域的底物濃度一致。
3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產生了邊緣效應。最外側的組織片最好離顯色液外緣0.5 cm。
Q10：染色過強
1）抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）；
2）孵育溫度過高；
3）DAB顯色時間過長或DAB濃度過高，顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準。
Q11：非特異性背景染色
1）操作過程中沖洗不充分；
2）組織中含過氧化物酶未阻斷 ，可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時間延長；
3）組織中含內源性生物素，可用正常非免疫動物血清再封閉；
4）血清蛋白封閉不充分，可延長血清蛋白封閉時間。
Q12：染色弱
1）抗體濃度過低，孵育時間過短，可提高抗體濃度，孵育時間不能少于60分鐘；
2）試劑超過有效使用期 及時更換試劑；
3）操作中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋，可每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）；
4）室溫太低，低于15℃ 若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過夜）；
5）蛋白封閉過度，封閉時間不要超過10分鐘。
Q13：染色陰性
1）操作步驟錯誤 重新試驗，設立陽性對照；
2）組織中無抗原 設立陽性對照片，以驗證實驗結果；
3）一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗與二抗種屬無誤。